Определение статуса метилирования сайтов RCGY в геноме человека: сравнение результатов NGS GlaI-гидролизатов и данных GlaI-ПЦР анализа
М.А. Абдурашитов, А.Г. Акишев, С.Х. Дегтярев1
1 ООО «СибЭнзайм», Новосибирск
автор для переписки: Абдурашитов М.А., ООО СибЭнзайм, ул. Тимакова, д. 2/12, Новосибирск, 630117, Россия; тел.: +7(383)333-4991; факс: +7(383)333-6853; E-mail: abd@sibenzyme.ru
Резюме
5-метилцитозин-зависимая ДНК-эндонуклеаза GlaI узнаёт в ДНК и расщепляет сайты 5′-R(5mC)GY-3′ / 3′-YG(5mC)R-5′, которые образуются de novo в геноме человека под действием ДНК-метилтрансферазы DNMT3. Благодаря своей специфичности фермент GlaI эффективно используется для определения статуса метилирования сайтов RCGY в геноме человека. Геномное картирование сайтов R(5mC)GY осуществляется методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) гидролизатов ДНК, полученных расщеплением GlaI, тогда как анализ отдельных фрагментов ДНК может быть выполнен с помощью GlaI-ПЦР анализа.
В данной работе проведено сравнение результатов NGS анализа GlaI-гидролизатов ДНК и данных GlaI-ПЦР анализа регуляторных областей 11 генов-онкосупрессоров в ДНК клеточных линий человека L68 (нормальные фибробласты лёгких), Raji (лимфома Беркитта) и U937 (гистиоцитарная лимфома). Показано, что в ДНК клеток L68 большинство исследованных регуляторных участков неметилированы, тогда как в ДНК злокачественных клеточных линий Raji и U937 наблюдается их метилирование. За исключением одного участка для всех остальных исследованных фрагментов статус метилирования, определённый методом GlaI-ПЦР анализа, полностью коррелирует с количеством сайтов R(5mC)GY, выявленных методом NGS.
Единственное расхождение между данными двух методов было выявлено в случае регуляторного участка гена RASSF1A в ДНК клеток L68, которое объясняется наличием аллель-специфического метилирования, подтверждённого дополнительным GlaI-ПЦР анализом в режиме реального времени. С учётом наличия аллельного метилирования регуляторного участка гена RASSF1A можно говорить о полном соответствии между данными NGS GlaI-гидролизатов и GlaI-ПЦР анализа ДНК регуляторных областей изученных генов-онкосупрессоров клеточных линий человека L68, Raji и U937.
Таким образом, методы NGS анализа GlaI-гидролизатов ДНК и GlaI-ПЦР анализа являются взаимодополняющими и позволяют надёжно выявлять аномально метилированные участки генома в нормальных и опухолевых клетках, что делает их перспективными инструментами для эпигенетических исследований и ДНК-диагностики.Ключевые слова: 5-метилцитозин; метилирование ДНК; метилзависимые эндонуклеазы рестрикции; GlaI; NGS-анализ; GlaI-ПЦР анализ; эпигенетическая ДНК-диагностика;
аллель-специфическое метилирование.
DOI: 10.26213/3034-4298.2025.6.1.001
Данные для цитирования:
М.А. Абдурашитов, А.Г. Акишев, С.Х. Дегтярев (2025) Определение статуса метилирования сайтов RCGY в геноме человека: сравнение результатов NGS GlaI-гидролизатов и данных GlaI-ПЦР анализа, Эпигенетическая ДНК диагностика, том 2025(1), DOI: 10.26213/3034-4298.2025.6.1.001
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons…