GlaI

М.А. Абдурашитов, А.Г. Акишев, С.Х. Дегтярев1 1 ООО «СибЭнзайм», Новосибирск автор для переписки: Абдурашитов М.А., ООО СибЭнзайм, ул. Тимакова, д. 2/12, Новосибирск, 630117, Россия; тел.: +7(383)333-4991; факс: +7(383)333-6853; E-mail: abd@sibenzyme.ru Резюме 5-метилцитозин-зависимая ДНК-эндонуклеаза GlaI узнаёт в ДНК и расщепляет сайты 5′-R(5mC)GY-3′ / 3′-YG(5mC)R-5′, которые образуются de novo в геноме человека под действием ДНК-метилтрансферазы DNMT3. Благодаря своей специфичности фермент GlaI эффективно используется для определения статуса метилирования сайтов RCGY в геноме человека. Геномное картирование сайтов R(5mC)GY осуществляется методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) гидролизатов ДНК, полученных расщеплением GlaI, тогда как анализ отдельных фрагментов ДНК может быть выполнен с помощью GlaI-ПЦР анализа. В данной работе проведено сравнение результатов NGS анализа GlaI-гидролизатов ДНК и данных GlaI-ПЦР анализа регуляторных областей 11 генов-онкосупрессоров в ДНК клеточных линий человека L68 (нормальные фибробласты лёгких), Raji (лимфома Беркитта) и U937 (гистиоцитарная лимфома). Показано, что в ДНК клеток L68 большинство исследованных регуляторных участков неметилированы, тогда как в ДНК злокачественных клеточных линий Raji и U937 наблюдается их метилирование. За исключением одного участка для всех остальных исследованных фрагментов статус метилирования, определённый методом GlaI-ПЦР анализа, полностью коррелирует с количеством сайтов R(5mC)GY, выявленных методом NGS. Единственное расхождение между данными двух методов было выявлено в случае регуляторного участка гена RASSF1A в ДНК клеток L68, которое объясняется наличием аллель-специфического метилирования, подтверждённого дополнительным GlaI-ПЦР анализом в режиме реального времени. С учётом наличия аллельного метилирования  регуляторного участка гена RASSF1A можно говорить о полном соответствии между данными NGS GlaI-гидролизатов и GlaI-ПЦР анализа ДНК регуляторных областей изученных генов-онкосупрессоров клеточных линий человека L68, Raji и U937. Таким образом, методы NGS анализа GlaI-гидролизатов ДНК и GlaI-ПЦР анализа являются взаимодополняющими и позволяют надёжно выявлять аномально метилированные участки генома в нормальных и опухолевых клетках, что делает их перспективными инструментами для эпигенетических исследований и ДНК-диагностики.Ключевые слова: 5-метилцитозин; метилирование ДНК; метилзависимые эндонуклеазы рестрикции; GlaI; NGS-анализ; GlaI-ПЦР анализ; эпигенетическая ДНК-диагностика; аллель-специфическое метилирование. DOI: 10.26213/3034-4298.2025.6.1.001 Данные для цитирования: М.А. Абдурашитов, А.Г. Акишев, С.Х. Дегтярев (2025) Определение статуса метилирования сайтов RCGY в геноме человека: сравнение результатов NGS GlaI-гидролизатов и данных GlaI-ПЦР анализа, Эпигенетическая ДНК диагностика, том 2025(1), DOI: 10.26213/3034-4298.2025.6.1.001 Эта статья доступна по лицензии Creative Commons…

Методом GLAD-ПЦР анализа определяли метилирования сайтов RCGY в регуляторной области гена FAM19A4 (Хр3: 68932451 - 68932800) в препаратах ДНК малигнантных клеточных линий человека Raji, Jurkat, HeLa, U-937 и контрольной ДНК клеточной линии фибробластов легких L68. Показано, что октануклеотид GCGCGCGC (Хр3: 68932500), находящийся в первом экзоне гена FAM19A4, расщепляется приблизительно в равной степени в ДНК всех 4-х малигнантных клеточных линий человека, тогда как в ДНК L68 этом сайт гидролизуется в 10-15 раз слабее. Эти результаты соответствуют полученным ранее данным эпигеномного секвенирования ДНК L68, Raji и U-937. Метилирование CG-динуклеотидов в позициях 68932727 и/или 68932740 в районе промотора гена FAM19A4 происходит только в опухолевых ДНК и не наблюдается в ДНК L68, а метилирование CG-динуклеотида в позиции 68932704 наблюдается только в ДНК HeLa.

Методами GlaI- и FatI-ПЦР анализа определяли частоты вариантов полиморфизма 5mC/T в положении хр1: 245618129 (по геномной сборке GRCh38.p13) в препаратах ДНК, выделенной из клеток крови 92 человек. Исследование включало (1) выделение лейкоцитарной ДНК из клеток крови, (2) проведение GlaI- и FatI-ПЦР анализа фрагмента ДНК хр1: 245617889 - 245618464, (3) определение 5-метилцитозина и тимина в позиции хр1: 245618129 в анализируемых препаратах ДНК и (4) сравнительный анализ полученных результатов. Показано, что 43 донора (46,74%) имеют гетерозиготный набор C/T в положении хр1: 245618129, 28 доноров (30,43%) гомозиготны по T, а 21 донор (22,83%) – по C. Таким образом, принимая во внимание, что клетки крови имеют диплоидный набор хромосом, замена C на T встречается в 99 из 184 проанализированных вариантов (53,8%). При этом из полученных результатов следует, что цитозин в положении хр1: 245618129 в бОльшей части молекул ДНК находится в метилированной форме (5-метилцитозин).

Методами GlaI- и FatI-ПЦР анализа определяли частоты вариантов полиморфизма 5mC/T в повторе AluSx в положении хр16: 75033884 (по геномной сборке GRCh38.p13) в препаратах ДНК, выделенной из клеток крови 92 человек. Исследование включало (1) выделение лейкоцитарной ДНК из клеток крови, (2) проведение GlaI- и FatI-ПЦР анализа фрагмента ДНК хр16: 75033860 - 75033957, (3) определение 5-метилцитозина и тимина в позиции (хр16: 75033884) в анализируемых препаратах ДНК и (4) сравнительный анализ полученных результатов. Показано, что 53 донора (57,61%) имеют гетерозиготный набор C/T в положении хр16: 75033884, 19 доноров (20,65%) гомозиготны по T, а 20 доноров (21,74%) – по C. Таким образом, принимая во внимание, что клетки крови имеют диплоидный набор хромосом, замена C на T встречается в 91 из 184 проанализированных вариантов (49,46%). При этом из полученных результатов следует, что цитозин в положении хр16: 75033884 в бОльшей части молекул ДНК находится в метилированной форме (5-метилцитозин), что согласуется с положением о преимущественном метилировании CG-динуклеотидов в Alu-повторах.

Методом GlaI-ПЦР анализа изучали метилирование сайта ACGC в гене SIPA1 в положении хр11: 65647266 (согласно базе данных GRCh38 PrimaryAssembly) в препаратах ДНК, полученных из легкой фракции клеток крови доноров и больных раком молочной железы на ранних стадиях заболевания. Исследование включало а) получение легкой фракции клеток крови, б) выделение геномной ДНК, в) установление методом ПЦР в реальном времени концентрации геномной ДНК, г) определение методом GlaI-ПЦР-анализа концентрации неметилировнного сайта ACGC в положении хр11: 65647266 в препаратах ДНК из легкой фракции клеток крови и д) определение доли молекул ДНК, содержащих неметилированный сайт ACGC, выраженной в процентах от общего количества молекул ДНК. GlaI-ПЦР анализ показал, что у более чем 82% доноров доля неметилированного сайта ACGC в положении хр11: 65647266 в ДНК из легкой фракции клеток крови составляет 3% и менее, тогда как у приблизительно 70% больных РМЖ процент неметилированного сайта ACGC выше и находится в диапазоне от 3,2 до 6,4%. Эти данные позволяют предположить, что при РМЖ на ранних стадиях у 2/3 больных в ДНК небольшой части лейкоцитов (до 3,5%) происходит деметилирование сайта A(5mC)GC в гене SIPA1 в положении 65647266. Данные, представленные в данной работе, могут быть использованы для разработки ПЦР тест-системы, позволяющей исключить РМЖ на ранних стадиях. Метод GlaI-ПЦР анализа не требует сложного и дорогостоящего оборудования и реактивов, а само исследование может проводиться в стандартной ПЦР-лаборатории в ходе ежегодных профилактических обследований и анализа крови.

В настоящей работе представлены результаты картирования  метилированных сайтов RCGY в геномах двух  малигнантных клеточных линий и контрольной клеточной линии фибробластов легких. Проведенный анализ выявил существенные отличия по метилированию генов, повторов, CpG-островков между тремя геномами. Обнаружены различия по степени метилирования  различных групп повторов, которые, возможно, могут быть использованы в диагностических целях при условии разработки достаточно чувствительных методов анализа. Создана база данных, содержащая результаты картирования метилированных сайтов в геномах. Полученные данные по метилированию регуляторных участков различных генов, сопоставленные с ранее опубликованными данными, могут быть использованы для поиска маркеров метилирования для диагностики онкологических и некоторых других заболеваний. Таким образом, разработанный простой и нетрудоемкий метод картирования метилированных сайтов R(5mC)GY в геномах может быть использован на практике.